Enseignement


Jan 26, 2013

HARMONISATION DU PROTOCOLE DE DIAGNOSTIC DE L'HEMOGLOBINURIE PAROXYSTIQUE NOCTURNE


SE Belakehal1, D Saidi2, MC Brahimi3, S Oukid4, H Hammouda5, F Harieche6, A Oularbi7, M Malika7, S Benichou8, S Mehlal9, O Djidjik9, FZ Ardjoun1, H Touhami2, A Bekadja3, MT Abad4, S Hamdi5, RM Hamladji6, H Ait Ali7, Z Zouaoui8, M Belhani9
1 Service d'hématologie HCA; 2 Service d'hématologie CHU Oran; 3 Service d'hématologie EHU Oran; 4 Service d'hématologie CAC Blida ; 5 Service d'hématologie CHU Sétif , 6 Service d'hématologie, CPMC, Alger, 7 Service d'hématologie, CHU Tizi-Ouzou, 8 Service d'hématologie, CHU Sidi-Bellabes, 9 Service d'immunologie et d'hématologie, CHU Benimessous.


Résumé :

      Introduction : L'hémoglobinurie paroxystique nocturne (HPN) est une maladie rare de la cellule souche hématopoïétique, due à une mutation somatique acquise du gène PIG-A. Il en résulte un blocage de la synthèse des molécules d'ancrage de glycophophatidylinositol (GPI), responsables de la fixation de nombreuses protéines à la surface cellulaire. Parmi celles-ci, on retrouve le CD59 et le CD55, protéines inhibitrices du complément, qui empêchent normalement l'assemblage final du complexe d'attaque membranaire (Cam). L'HPN est la conséquence d'un déficit d'ancrage membranaire de ces deux protéines, se manifestant sur le plan clinique par une hémolyse intravasculaire. La cytométrie en flux est la méthode de choix pour l'identification des déficits cellulaires en molécules GPI.
     
      Méthodes : Lors du 4ème workshop sur l'HPN, organisé en juin 2010, le Groupe Algérien de Cytométrie en flux à mis en point un consensus sur les indications et la description de la procédure de détection d'un clone HPN par cytométrie en flux. Une deuxième relecture du protocole a été nécessaire, pour la validation définitive du protocole.
      
      Résultats : Nous avons discuté pendant ce workshop les critères d'inclusion pour un immunophénotypage par cytométrie en flux, la fiche de demande d'immunophénotypage pour une HPN, le protocole d'acquisition, la stratégie de gating, et le compte rendu de la CMF.
      
      Conclusion : Ce document est une référence pour les laboratoires d'analyse par cytométrie en flux dans le diagnostic d'une HPN.

Mots clés : cytométrie en flux, hémoglobinurie paroxystique nocturne, harmonisation du protocole.

INTRODUCTION

Gull puis Strübing décrivent à la fin du XIX siècle les observations de patients présentant une asthénie, une hémoglobinurie intermittente accompagnée d'hémolyse intravasculaire [1]. Marchiafava et Nazani en 1911, puis Micheli en 1931, établissent le tableau clinique classique de la maladie qui porte leur nom (maladie de Marchiafava-Micheli). Enneking introduit à la même période le terme d'hémoglobinurie paroxystique nocturne (HPN) [2]. L'HPN est aujourd'hui considérée comme une maladie de la cellule souche hématopoïétique, de nature clonale.
Depuis le début des années 1980, les progrès de la cytométrie en flux puis, ont conduit à une réelle avancée dans la connaissance de la physiopathologie de cette maladie rare (460 cas diagnostiqués en 50 ans ; données de la Société française d'hématologie [SFH] [3]).

CRITERES D'INCLUSION POUR UN IMMUNOPHENOTYPAGE PAR CYTOMETRIE EN FLUX

- Toutes les aplasies médullaires acquises,
- Anémie réfractaire avec bilan d'hémolyse perturbé (LDH, RETICULOCYTE),
- Hémoglobinurie,
- Anémie hémolytique auto-immune à TCD négatif,
- Thromboses artérielles et veineuses avec sites atypiques : thrombose cérébrale, Budd-Chiari, après avoir éliminé un syndrome myéloprolifératif, et une thrombophilie,
- Cytopénie inexpliquée, avec une moelle riche et des signes de dysplasie,
- Episodes de dysphagie et / ou de douleurs abdominales avec un bilan d'hémolyse perturbé (LDH, RETICULOCYTE).

FICHE DE DEMANDE D'UN IMMUNOPHENOTYPAGE POUR HPN

Cette fiche doit être accompagnée d'une formule de numération sanguine systématique, et doit comporter le nom, le prénom, la date et lieu de naissance, la profession, et les antécédents personnels :
- Toxiques : OUI / NON
- Transfusion :
   - OUI / NON
   - Fréquence :
   - Date de la dernière transfusion :
- Thrombose : OUI / NON
- Traitement immunosuppresseur : OUI / NON, si OUI, préciser :

PROTOCOLE D'ANALYSE

a. PRELEVEMENT ET ACHEMINEMENT :

Malade et témoin : dans les mêmes conditions
- Sang veineux, dans un tube à EDTA, et exceptionnellement dans un tube hépariné,
- Quantité de sang : 3 ml,
- Le prélèvement doit être fait de préférence au niveau du centre d'immunophénotypage. Exception faite pour les patients avec une altération de l'état général. 2 tubes doivent être envoyer dans moins de 48H, l'un conservé à +0°C et l'autre à température ambiante.

b. LES COMBINAISONS D'ANTICORPS ET DE FLUOROCHROMES :

- pour les hématies :
- CD59 - PE (clone MEM 43),
- Glycophorine A (CD235a) – FITC pour le gating
- L'analyse seule des hématies n'est pas recommandée

- pour les polynucléaires neutrophiles :
- CD59 et le CD55 ne sont aps recommandés
- CD66b-FITC
- CD24-PE
- CD33 ou CD15 troisième couleur, pour le gating, et de préférence le   CD15.

- pour les monocytes :
- CD14 – PE
- CD64 – FITC
- CD33 - Troisième couleur

- pour les lymphocytes :
- L'analyse des lymphocytes en routine n'est pas recommandée

- Pour les cytomètres 4 couleurs : on rajoute le CD45 – Quatrième couleur
- Les contrôles négatifs ne sont pas nécessaires.
- FLEAR sous forme liquide (Ptox Biotech, Victoria BC, Canada) : doit être utilisé dans un avenir très proche en Algérie, pour l'analyse des globules blancs.

Figure 1 : clone HPN ; symposium HPN, 31 janvier 2008, Dr RF de LATOUR

c. LA LYSE
- quand on utilise 3 couleurs : on fait une lyse wash,
- quand on utilise 4 couleurs : on fait une lyse no wash,
- on utilise la FACS lyse diluée pour les cytomètres BD,
- on utilise la Versalyse non diluée pour les cytomètres BC,
- quantité : 2 ml (diluée au 1/10è)
- on n'utilise pas de lyse pour les hématies.

d. LA PREPARATION DES GLOBULES BLANCS
1.prendre 100 ml de sang total,
2.on ne lave pas avec du PBS,
3.centrifugation à 1000 T/min, pendant 5 min
4.on rajoute 10 ml d'anticorps dans chaque tube (voir les recommandations du fournisseur),
5.incubation 15 à 20 min à l'obscurité,
6.ajouter 2 ml de lyse diluée (FACSLYSE) au 1/10ème,
7.laisser 10 minutes à l'abri de la lumière, à température ambiante,
8.centrifugation à à 1000 T/min, pendant 5 min,
9.on lave 2 fois avec du PBS (3ml),
10.reprendre le culot dans 250 ml à 500 ml cell wash,

e. LA PREPARATION DES HEMATIES
1.On prépare un cocktail d'anticorps [15 ml de glyco A -FITC + 5 ml de CD 59-PE + 180 ml de PBS], puis on agite délicatement le culot avec le vortex, et on conserve le tube fermé à + 4°C et à l'abri de la lumière,
2.faire un frottis sanguin coloré au MGG,
3.prendre [10 ml de sang total + 1 ml de PBS], on agite délicatement le culot avec le vortex,
4.on prépare 2 tubes :
I)dans le tube 1 et tube 2 : mettre 50 ml de sang lavé
II)dans le tube 2 : mettre 20 ml du cocktail d'anticorps, puis on mélange délicatement avec la pipette,

5.incubation pendant 30 min à l'obscurité, et à température ambiante,
6.on agite délicatement le culot avec le vortex,
7.on lave avec 4 ml de PBS + racking, puis on centrifuge à 1000 T/min, pendant 5 min,
8.puis on lave avec 4 ml de PBS + racking, puis on centrifuge à 1000 T/min, pendant 5 min,
9.reprendre le culot dans 1 ml PBS

L'ACQUISITION :

- il faut faire les réglages (setting) pour :
   - les globules blancs,
   - et les hématies, à l'échelle logarithmique,
- nombre d'événements pour les hématies : 100 000 événements,
- nombre d'événements pour les globules blancs : 35 000 événements,
- nombre d'événements pour les globules blancs, si on utilise le FLEAR,
   - pour une sensibilité de 1% : 5 000 événements,
   - pour une sensibilité de 0,01 % : 250 000 événements,

L'ANALYSE ET LA STRATEGIE DE FENETRAGE :

1) premier dot plot : globules blancs : Pour définir les « gates » des granuleux et des monocytes
- CD13/SSC ou CD33/SSC (quand on utilise 3 couleurs)
- CD45/SSC, suivi du CD33/SSC (quand on utilise 4 couleurs)

2) deuxième dot plot : globules blancs : FSC/SSC, en multicolor gating et en linéaire

3) puis analyse des autres dots plot (CD14, CD66b, en biparamétrique et en monoparamétrique)

4) Premier dot plot : hématies : Glycophorine A/SSC

5) Deuxième dot plot : hématies : Glycophorine A- FITC / CD59-PE

Figure 2 : clone HPN sur les hématies, M J Borowitz, ESCCA 2010,

LES COMBINAISONS D'ANTICORPS MONOCLONAUX



Tableau 1 : Recommandations internationales des combinaisons d'anticorps, ESCCA 2010

LE COMPTE RENDU DE CMF :

Un diagnostic d'HPN : nécessite impérativement de démontrer la présence d'un déficit  5% avec 2 marqueurs différents et sur 2 types cellulaires différents.

- Dans le compte rendu, on doit obligatoirement préciser les (%) du type I, du type II, et du type III.
- On doit dire « présence d'un clone HPN de « X »% sur « X » populations.

CONCLUSION :

- Le diagnostic d'HPN en Algérie ne pose guère de problème depuis les progrès de la cytométrie en flux et la mise en place de centres de diagnostics.
- Pour une meilleure standardisation de la technique, le Groupe Algérien de Cytométrie (GAC) a adopté un protocole simple, pratique et harmonisé, pour tous les laboratoires d'immunophénotypage, afin d'éviter les erreurs de diagnostique et de pouvoir faire des contrôles de qualité externes inter laboratoires.

BIBLIOGRAPHIE :

[1] Strubing P. Paroxysmale haemoglobinurie. Dtsch Med Wochenschr 1882; 8:1–3.
[2] Enneking J. Eine neue form intermittierender haemoglobinurie (haemoglobinuria paroxysmalis nocturia). Klin Wochenschr 1928; 7:2045.
[3] Peffault de Latour R, Mary JY, Salanoubat C, Terriou L, Etienne G, Mohty M, et al. Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria: natural history of disease subcategories. Blood 2008;112:3099–106.
[4] Michael J. Borowitz, Fiona E. Craig, Joseph A. DiGiuseppe, Andrea J. Illingworth, Wendell Rosse, D. Robert Sutherland, Carl T. Wittwer, Stephen J. Richards . Guidelines for the diagnosis and monitoring of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria and related disorders by flow cytometry. Cytometry Part B: Clinical Cytometry 000B: 00-00 (2010).
[5] Stephen J. Richards, Peter Hillmen. Advances in the laboratory diagnosis of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria. Clinical and Applied Immunology Reviews 1 (2001) 315–330.





ARTICLES PUBLIES A L'ETRANGER



PRESSE (nouveau)



PHOTOTHEQUE (nouveau)



News :

Date: 16 et 17 février 2018
Lieu: Alger (Hotel Mercure)



le 23 et 24 mars 2018 au service d'hématologie HCA



Date : 14 Avril 2018
Lieu : Alger (Hotel Mercure) 



Dates : 04 et 05 Mai 2018
Lieu: Tunisie (Tunis)      




Date : 02 et 03 Mars 2018
Lieu : Alger (Hotel Mercure) 



En marge du 14ème CNH, s'est tenue l'assemblée générale élective de la SAHTS



CNH 2017



Reccueil des communications du 14 ème congrès national d’Hématologie





Le 15ème congrès maghrébin d’hématologie se tiendra à l'Hôtel Golden Tulip Gammarth du 03 au 05 Mai 2018.

Cher docteur,

L'inscription en ligne pour le congrès maghrébin d'hématologie est obligatoire et doit se faire sur le site suivant : www.sth.tn

La soumission des e-posters se fera à travers le module de suivi « My Abstract » dont voici le lien :

http://eventek-tn.com/sth2018/abstract/myabstract.html

Une fois connecté à votre session en utilisant votre adresse mail et le numéro de votre résumé, vous devez télécharger le fichier Powerpoint avec votre e-poster sous le format 09/16ème (en portrait selon le template ci-joint).

Template 01 | Template 02 | Template 03 | Template 04

La soumission des e-posters se fera entre le 23 et le 30 avril à 00h00.

La soumission de vos présentations orales se fera à travers le module de suivi « My Abstract » dont voici le lien: http://eventek-tn.com/sth2018/abstract/myabstract.html

Une fois connecté à votre session en utilisant votre adresse mail et le numéro de votre résumé, vous devrez télécharger votre présentation power point avant le 1er mai à minuit . Les présentations ne doivent pas dépassées les 15 diaporamas. Votre temps de parole sera de 10mn.

Le bureau de la STH.